关于高效液相等度洗脱，流动相比例越简单越好，能不用缓冲盐就不用，洗脱方法越简单越好、色谱柱越常见越好，但是有的时候用单一比例的流动相或者是常见色谱柱是无法满足很多杂质的分离，这时就需重新开发色谱分离方式。
1、确定目标化合物性质
首先需要明白待分离杂质的一些性质，比如说分子量、结构式（主要看有哪种基团），以及该种物质在哪种有机溶剂中易容。结构式对于分子极性大小的预测以及判定该物质是否容易水解有非常重要的作用。例如我们常见的-、-NHR、-、-COOH、-0H等都是比较常见的极性基团；而常见的苯环、-CH=、--等都是常见的非极性基团。根据经验可以大致的判断一下物质的极性，预估一下在常用的色谱柱上是否保留，再结合杂质在各种常见洗脱溶剂中的溶解性，例如在甲chun、乙jing、正己wan中哪个比较易溶，选择适合用于洗脱的有机流动相，从而确定方法开发时是用正相色谱柱或者是反向色谱柱做出粗略判断。
2、确定正反相洗脱方式
确定洗脱方式后，反向的话个人推荐先用60%的乙jing或者是甲chun，先去看一下你需要分离的几种物质能否被分开，（正相洗脱方式思路相近）。在能分开的前提下，再看一下最后一个峰的出峰时间，如果时间比较长的话，再根据前几个峰的分离度确定是否需要加大或者缩小有机相的比例。我们常见的洗脱分离方式为反相分离，而反相洗脱方式又分为两种体系，一种是甲chun-水体系，另外一种是乙jing-水体系。
具体是选择哪种反相洗脱体系需要根据以下条件来决定：
A、乙jing的洗脱能力要优于甲chun，在同等浓度、样品下乙jing-水体系的目标峰出峰要快于甲chun-水体系。
B、甲chun溶于水是会放出热量的，乙jing溶于水是会吸热的，在同等方式的梯度洗脱方式下，在两种流动相互相混合时由于分子热运动的原因，甲chun溶于水比乙jing溶于水时的分子热运动剧烈，这样两种流动相的混合会更加均匀，反映在基线上的表现为基线更加的平滑，且梯度峰要更少。
C、甲chun在市面上的售价要低于乙jing（如果财大气粗的公司可以忽略这一条）。
D、甲chun的分子量大于乙jing，在同一色谱柱、相同浓度的有机相浓度下，乙jing-水体系的柱压更小。
E、甲chun的截止吸收波长在210nm附近，而乙jing的截止吸收波长在190nm附近，在检测波长远离210nm的时候选择甲chun或是乙jing-水体系主要看其它影响因素。但是测定波长在210nm附近时，由于甲chun的截止吸收波长大于乙jing，除了流动相不同外，相同的测定条件下，乙jing-水体系测定的样品响应值更高，从而能够得到更小样品检出限，此时建议优选乙jing-水体系。
图1 以甲chun-水为体系的系统适用性图谱
图2 以乙jing-水为体系的系统适用性图谱
上述两个图中图2比图1多加入一种杂质，即图2中的峰5，其余杂质的种类不变、出峰位置不变，上述两图主要看图谱的基线与各杂质的出峰位置。
3、确定色谱柱、流速、柱温
实验室分析中最常用的就是类型的色谱柱，一般为5μm0.46×250mm或者是0.46×150mm，在试验前期如果在没有参考资料的情况下，最为普通的 5μm0.46×250mm的色谱柱试一下；如果发现用5μm0.46×250mm的色谱柱去分离多种杂质时，有分叉峰出现或是理论塔板数比较低时则提示我们这种类型的色谱柱对该物质的分离是不太好的，需要我们更换柱效更高的色谱柱，通常选择粒径、填料更小的色谱柱，这个需要根据实际情况，进行试验后确定适用于检测的色谱柱。
而流速的选择通常是要根据色谱柱的具体类型，最高的耐受压力来决定，常用的色谱柱一般流速为1.0mL/min，其实流量对杂质分离的影响比较小。
柱温室温，柱温的升高会影响杂质的出峰快慢，理论上柱温越高，各种物质的出峰会越快，同时色谱柱的柱压也会越小，但是由于温度比较高会导致色谱柱中填料的健合相容易被流动相冲刷下来，导致色谱柱不可逆的柱效下降。因此色谱柱温度不宜过高，一般温度设定为25~35℃，当然也有特殊的品种有的需要柱温在40℃甚至更高。
4、梯度洗脱程序的筛选
在选择好用正反相洗脱方式、确定用的色谱柱、柱温、流速后，无论如何调整梯度及流动相比例都无法将两种杂质分离开后，那么就需要用到梯度洗脱方式。梯度洗脱是一种在不同的时间加入不同有机比例流动相的一种洗脱方式。与传统的等度相洗脱方式比具有以下优点：
A、能够增加两种物质的分离度，通过不同时间段加入有机相浓度的不同，使杂质在不同时间段受到有机相洗脱的浓度不同，一般原则是逐步增加有机相的比例，从而使难被洗脱出来的杂质加快出峰。
B、由于可以调整有机相加入的浓度，与等度洗脱相比，可以缩短分析时间，还可以一次性将等度洗脱分不开的几种物质分开，从而用一种分析方法分析多种物质，降低成本。
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